海水养殖动物致病弧菌的研究进展

    近年来，随着海水鱼类养殖的不断扩大，鱼类病害频繁发生，对海水鱼类规模化养殖和发展造成了巨大的威胁，尤以弧菌病最为严重。海水养殖鱼类弧菌病的研究已日成为人们关注的焦点。
    弧菌(Vibrio)是海洋环境中最常见一类条件致病菌。近年来，由于养殖水域生态变化，弧菌已成为海水养殖动物的主要病原菌之一。因此，该类疾病一直备受国内外研究工作者的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。笔者将对弧菌病的病原、流行病学、诊断、防治的研究进展和趋势综述如下。

    1 弧菌病的病原及其种类

     弧菌病是最早发现的鱼类细菌性疾病之一，引发弧菌病的病原性弧菌最早是从患病的欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)中分离到的，当时这种致病菌被命名为鳗杆菌(Bacillus anguilla)，1909年，Bergman再次从患病欧洲鳗鲡中分离到致病性弧菌，对其进行了比较详细理化特性鉴定后，将其更名为鳗弧菌(V．anguillarum)。从此对病原性弧菌的研究成为研究水生动物病原菌的热点。迄今为止，已被报道过的海水养殖动物弧菌病病原菌有数十种之多(表1)。弧菌有许多致病种类和菌株，可引起养殖对象出现皮肤溃疡、烂尾、烂鳍、出血等症状，导致养殖动物对外界反应迟钝，摄食率下降或停止摄食等。目前，国内外已经报道的弧菌病病原主要有副溶血弧菌(V．parahaemolyticus)、鳗弧菌、溶藻弧菌(V．alginolyticus)、哈维氏弧菌(V．harveyi)、创伤弧菌(V．vulnificus)、拟态弧菌(V．mimicus)、产气弧菌(V．gazogenes)和河弧菌(V．fluvialis)等。

    2 流行病学

    为控制弧菌病的爆发，国内外学者已经开展了大量流行病学的调查。调查发现弧菌病的分布区域几乎为世界性的，其发生没有宿主的种属选择性和地理上的差异，也无具体的季节和时间上的区分，在一年四季及育苗、养成和越冬等各个阶段均有发生，夏秋两季为多发季节，其流行适宜温度为25～32℃，超过28℃时流行极为迅速，几日之内即可造成养殖动物的大量死亡。弧菌病多在高盐度的水体中流行。同时，弧菌病的爆发还与养殖动物机体的机能状态有着重要关系。如种质条件较差(因近亲繁殖等)，在养殖过程中，水体中的氨氮、硫化氢含量显著升高，养殖水体溶氧显著下降，在恶劣的气候条件如夏季闷热无风或突降暴雨，引起盐度和pH值的急剧变化，以及养殖动物受到其他疾病如病毒、真菌、寄生虫的感染等条件下，极易引起养殖动物的机能下降，病原弧菌乘机大量侵入，从而引起弧菌病的爆发。
    此外，吴定虎等对养殖水体、底泥中弧菌的数量及温度、溶氧等环境因子对弧菌的影响也进行了大量的研究。对弧菌的可能传播途径和感染模式也进行了许多探索，尤其对经喂饲感染、浸浴感染等方式做了大量的工作，这为弧菌病的防治研究提供了重要依据。 

    3 诊断检测技术

    病原在感染的早期阶段甚至在携带病原菌期间应被准确的诊断，因为在疾病的控制中正确的诊断最为关键。目前疾病的诊断方法主要有：外观症状的观察、光镜下直接镜检、组织病理学、电子显微镜超微切片、传统微生物方法(病原菌分离、培养、形态及生化鉴定)、活体鉴定、血清学方法、免疫学和分子生物学诊断(如DNA探针和PCR技术)等。当前，免疫学诊断方法、分子生物学诊断方法以及二者相互结合诊断方法越来越得到国内外学者的重视。
    吴后波利用传统微生物方法根据细菌分类原理和《伯杰氏系统细菌学手册》的生化鉴定特征，找出最能区别弧菌属各种的15项主要特征，制成弧菌属常见种的快速简易生化鉴定系统，对待定鱼类病原菌进行快速鉴定。黄倢等制备单克隆抗体，在对养殖对虾爆发性流行病的病原及传播途径的调查中，发挥了重要的作用。张晓华报道了利用副溶血弧菌免疫家兔制备多克隆血清，建立中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)病原菌一副溶血弧菌的间接荧光抗体检测技术，不仅可用于诊断发病的感染对虾，也可用于检测带菌状态或未发病的感染对虾；Said等利用基因探针技术、ELISA对霍乱弧菌非O1菌株的毒素进行了检测；Biosca等利用ELISA技术对创伤弧菌进行了鉴定；Gitika等用RT-PCR快速检测了创伤弧菌；Mark等也用RT-PCR分析了从牡蛎中分离的创伤弧菌；Michael等用PCR技术检测到墨西哥湾中的最新流行的副溶血弧菌O3菌株；彭宣宪等采用通用引物PCR配合SSCP分析即UPP-PCR-SSCP技术，对弧菌科弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻弧菌、弗尼斯弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌的16SrRNA基因进行检测。

    4 弧菌病防治的研究

    4．1 药物防治
    目前，控制水产动物弧菌病的主要手段是抗菌药物治疗。宋晓玲等研究了l5种常见水产药物对海洋弧菌的杀灭作用；王雷等观察了11种天然药物对弧菌的体外抑制效果；郑国兴对养殖对虾弧菌病病原菌非0l群霍乱弧菌的药物敏感性研究等，均获得了一定成果；吴后波等发现磺胺类药物能有效地控制由哈维氏弧菌引起的高体鰤弧菌病的发生，对该病的治愈率达75％，是治疗该病的首选药物；张晓华等研究表明，海湾扇贝病原菌漂浮弧菌(V．natriegen)对新霉素、氯霉素、磺胺+TMP、美洛西林、多粘霉素最为敏感，这5种药物可以作为治疗海湾扇贝病害的首选药物；常建波等的研究结果显示，牙鲆弧菌病的病原菌一河弧菌-I对环丙沙星、利福平、链霉素、红霉素、呋喃妥因、氟哌酸等药物敏感；并根据该结果，对发病鱼投喂添加5.0×10-5(m／m，鲜鱼质量)氟哌酸和呋喃妥因的饲料进行了治疗试验，同时采取了加大换水量的措施，取得了较好的效果。但对于药物防治的大多数报道仅局限于对病原菌的药敏试验，很少有进一步的研究；而且，药物的作用仅仅在于控制病原体这个环节上，而对鱼体抗病力的改善及环境调节方面的作用非常有限。

    4．2 免疫防治
    弧菌病免疫预防的研究刚刚起步，国内外许多研究者作了大量研究，并取得成效，其研究内容主要为疫苗的使用和一些免疫刺激物的应用。
    4．2．1 疫苗
    应用疫苗免疫接种是防治鱼类病毒性和细菌性病害的有效方法。弧菌疫苗是水产养殖中最早应用的鱼类疫苗，目前在虹鳟(Oncorhymchus mykiss)、日本鳗鲡(A．japonica)和鲑科鱼类弧菌病免疫防治中应用广泛并已取得良好的效果(表2是已经商品化生产和销售的弧菌疫苗)。Itami等对弧菌病的免疫预防进行了较深入的研究，对口服、浸泡、注射、喷雾等方式接种疫苗的效果、免疫浓度和疫苗的持久性作了探讨，认为上述免疫方式均能提高对虾的免疫力且能持续50d；Morrison等研究了鳗弧菌疫苗对大西洋鲑(Salmo salar)的保护作用；Bricknell等研究发现，接种鳗弧菌疫苗的大西洋庸鲽(Hippoglossus hippoglossus)显示出极好的抗鳗弧菌能力(100％RPS)；Joosten等制备了微胶囊弧菌疫苗，通过对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和虹鳟的口服免疫接种，有效地预防了鳗弧菌感染；Lewis等将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体从高渗溶液转入含灭活弧菌疫苗的水体中，1～2 d后引起免疫反应，其免疫力可持续到成虾收获。余俊红等也研制了鳗弧菌口服微胶囊疫苗，可有效地降低鳗弧菌感染的死亡率；陶保华等血弧菌菌苗免疫斑节对虾(Penaeus monodon)，效果显著。 

    弧菌脂多糖(LPS)和外膜蛋白(OMP)均为弧菌的保护性抗原，可刺激机体产生特异性免疫应答和非特异性免疫反应。LPS作为保护性抗原在用弧菌疫苗免疫鲑的试验中已经得到证实；Kakamura用脂多糖制备物注射日本鳗鲡、牙鲆、虹鳟、真鲷(Pagrosomus major)，均诱导产生了良好的免疫反应；莫照兰等试验结果表明，鳗弧菌M3的脂多糖对牙鲆具有良好的免疫保护力。外膜蛋白也具有很好的免疫保护性，Chart等从鳗弧菌中分离出的2个小分子量的外膜蛋白，能有效地刺激机体的免疫反应。
    4．2．2 中草药制剂
    中草药具有天然性、无抗药性、无残留、无副作用、无环境污染、不引发药源性疾病等特点，其作用不仅对病原微生物有直接的抑制和杀灭作用，更重要的是对鱼类的免疫系统进行调整，提高水产动物的抗应激能力和免疫机能。通过中草药的使用提高水产动物的免疫力，提高动物抗病力，降低水产动物的发病率是近几年研究的热点。王吉桥等报道，投喂含金银花、人参和山楂等中草药的饲料，28、56d和83d后，大、中、小规格牙鲆血清溶菌酶分别提高了12.43％、15.38％～17.31％、14.43％～l7.56％，提高了其抗弧菌能力；刘立鹤等报道，当饲料中添加黄霉素4 mg／kg时，凡纳滨对虾血清的ACP活性最高，各试验组中血清中ACP显著高于对照组；柯浩等研究复方中草药对杂色鲍(Haliotis diversicolor)幼鲍血淋巴中ACP活力的影响，结果发现，除个别情况外，ACP活性显著高于对照组。
    4．2．3 微生态制剂
    近年来，益生菌制剂被广泛应用于水生动物的健康养殖中，因此，对水生动物微生态制剂的研制和机理性研究渐受关注。一方面，它利用有益菌改善养殖水体质量，为养殖动物提供一个良好的生活环境，同时水体中的有益菌也能随水流进入水生动物的消化道中。另一方面，微生态制剂被用作饲料添加剂还能促进动物对饲料的消化和利用、抑制病原菌的生长、优化和平衡水生动物肠道中固有菌群组成结构、刺激动物的免疫系统等，更重要的是它具有安全、无毒、无害、无副作用等特点。在水产养殖业中采用微生态制剂增强鱼类和对虾自身免疫系统的功能，通过提高其自身的抗病能力而达到预防疾病的目的，在国内外已经为不少生产者应用实践和研究结果证明是一条有效的途径。郭文婷等研究了不同配方微生态制剂对凡纳滨对虾血清中非特异性免疫因子的影响效果，测定了对虾血清中酚氧化酶、超氧化物歧化酶、溶菌活力。结果表明，试验组各项指标均优于对照组，表明所筛选的微生态制剂能有效增强对虾的非特异性免疫功能；朱学芝等研究发现，在基础饲料中分别添加1‰地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(B．subtilis)及二者的复合物(1：1)，能显著提高凡纳滨对虾血细胞总量及血清酚氧化酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶含量等非特异性免疫指标。
    4．2．4 其他免疫激活剂
    免疫激活剂通过增强非特异性防御机制来增强水产动物的免疫能力和抗病能力。Sakai报道，虹鳟注射壳聚糖后，其巨噬细胞活性增强，提高了抗鳗弧菌能力；大西洋鲑腹腔注射或口服酵母葡聚糖后，对鳗弧菌、杀鲑弧菌的抵抗力增强；斑节对虾经酵母葡聚糖溶液0.5、1.0 mg／L药浴可防止创伤弧菌感染；肽葡聚糖也能增强虹鳟抗弧菌感染能力；Vc可提高虹鳟对鳗弧菌、大西洋鲑对杀鲑弧菌感染的抵抗力，Navarre等报道在饲料中添加的500 mg／kg Vc能显著提高虹鳟感染鳗弧菌后的成活率，而且在半致死量注射感染后，投喂Vc 1000、2000 mg／kg的虹鳟几乎未发生死亡；虹鳟注射生长激素(GH)或口服转铁蛋白均可显著增强对鳗弧菌的抵抗力；注射过左旋咪唑的虹鳟，由于细胞吞噬活力和NK细胞活性增强，对鳗弧菌的抵抗力增强嘞 ；Kajita等报道，注射福氏完全佐剂(FCA)乳化的全菌苗的虹鳟增强了对弧菌病的抵抗能力。

    4．3 生态防治
    利用生态防治方法来控制水产动物弧菌病，其原理是根据同一生态系统中的不同微生物之间的相互作用和生物间的营养竞争等方式，达到防治弧菌病的目的。
    黄美珍研究了5株光合细菌对3株致病弧菌的抑制作用；李戈强等研究了不同条件下蛭弧菌(Bidellovibrio)对河弧菌的裂解作用，结果表明，在试验条件下，蛭弧菌对河弧菌具有明显的清除作用；李太武等依据过量噬菌体可以全部裂解其宿主菌河弧菌-Ⅱ的特性，用噬菌体对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)脓疱病进行了生物防治研究，结果表明，使用一定浓度的噬菌体可以有效地治疗或推迟脓疱病引起的鲍死亡，将鲍的成活率提高5O％以上；Lin等从养虾池中分离出来的一株假单胞菌，能明显降低斑节对虾苗繁殖场池水中病原性弧菌的数量；莫照兰等对弧菌的拮抗菌进行了筛选，发现气味黄杆菌(Flavobacterium odoratum)分泌的胞外物质具有广泛的弧菌抗菌谱，对哈维氏弧菌、漂浮弧菌和鳗弧菌均表现出较强的拮抗作用；Olsen等用微藻投喂2日龄的卤虫(Artemia franciscara)，发现投喂藻类可使卤虫体内的弧菌数量减少75％。

    5 存在问题与发展方向

    目前，关于病原菌感染试验尚缺乏统一标准，如试验动物的种类、密度、感染前的暂养情况、试验用水处理、通气条件、感染方式、饲料的投喂及其病原菌的培养条件、培养状态、细菌数量等，使得目前关于病原弧菌致病性的研究结果缺乏可比性，寻找合适的动物模型及采用统一试验标准对今后的研究很有必要。
    在特定情况下，将药物防病作为一种辅助的防治手段也是必要的。但由于长期滥用药物或抗生素引起水环境污染，从而导致养殖环境恶化，生态平衡失调；同时药物妨碍水产动物正常生长，进而诱发其他疾病，并导致耐药性微生物大量出现；而且，长期用药会导致整个群体的抗病能力下降。
免疫学方法在防治水产动物弧菌病方面已显示了良好的效果。通过免疫学技术激发机体自身的免疫防御系统，提高对各种病害的抵抗能力，被公认为是目前行之有效的一条途径。通过与现代生物技术相结合，使其发展为具有高效性、广泛性、可操作性的一门技术，在病害防治中正发挥着越来越重要的作用。
    当前，在弧菌病的免疫预防方面，疫苗的研制处于起步阶段，大多数为福尔马林灭活的全细胞疫苗，减毒疫苗还缺乏安全性保障，商品化生产还未开始，主要困难在于：疫苗在大面积使用时免疫效果欠佳；制备麻烦，尤其是减毒灭活技术要求较高，导致成本高，难以作大规模的生产；缺乏简易、高效、经济的接种途径。因此现在国内外学者对保护性抗原(脂多糖和外膜蛋白等)的研究形成了一大热点，进一步地寻求其共同保护性抗原和特异保护性抗原。
    生态防治可大量地降低治病过程中抗菌素、杀虫剂等药物的用量，保护了生态环境，同时降低了防治的费用，减少了病原微生物抗药性的产生，增强了治病的效果。在生产中应具有广泛的推广和应用前景。
    此外，随着海洋生物技术的发展，在对致病性弧菌基因组研究的基础上，分离克隆抗病基因，再将抗病基因导人养殖动物的受精卵，利用基因工程技术培育抗病良种，也将会成为综合防治海水养殖动物弧菌病的重要组成部分。