对虾免疫与疾病控制

中国水产门户网报道 
    最近几年，对虾养殖，尤其是南美白对虾的养殖在我国较为火热，尽管我国水产学者在对虾育苗（SPF虾苗）方面，虾农在养虾技术（如使用微生物制剂Probiotics）方面，均取得了一定的成绩，然而至今虾农依然“谈病色变”，对虾病害始终困扰着我国对虾养殖业的发展。不少学者提出，提高虾体自身的免疫能力，使之能对抗细菌、病毒等的侵袭，从而保证对虾健康生长。然而对虾的免疫系统及其免疫机理是什么，鲜有文章报道，本文就有关对虾免疫系统、免疫机理以及如何增强对虾的免疫能力方面作一简要论述，以期为我国对虾养殖的健康发展提供新的思路与依据。
　　
　　1 对虾免疫系统的地位
　　
　　对虾属低等的无脊椎动物，早在3000万年前出现，相对于哺乳动物而言，其免疫系统的地位非常低下，一般认为，对虾不具有免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应，不具有抗体和T淋巴等组成的特异防御机能，其免疫能力主要来自于非特异性的防御机能，如血细胞的吞噬、包封以及血淋巴中一些因子的杀菌、抗菌作用。
　　
　　2 对虾的免疫系统及其免疫机理
　　
　　2.1 对虾的甲壳及其屏障作用
　　
　　对虾的甲壳是覆盖在虾体表面的一层较坚硬的结构，肉眼可见为透明或半透明。主要的化学成分是几丁质及其结合钙。对虾的甲壳充当外骨骼，起支持及保护作用，在对虾的非特异性免疫过程中主要起机械屏障作用。许兵（1992）、马悦欣（1995）的致病菌感染试验都表明致病菌浸浴法不会影响对虾的成活率，而给虾体注射致病菌则很容易导致对虾死亡。
　　
　　2.2 对虾的鳃、血窦及其过滤作用
　　
　　对虾的鳃为枝鳃型结构，鳃腔中充填的和自由流动的是血淋巴，鳃腔和鳃丝顶端的囊状结构都可贮存被滤过的物质，此种异物可被游走到顶端囊状结构的血细胞吞噬，或随虾脱皮时一同脱掉。对虾血窦的实质是充满血淋巴的腔，对虾的血窦差不多布满了机体的各个部位，血窦在全身形成网络，进行动静脉血交换，交换过程中的异物被限制在血窦中，被血细胞吞噬，以免扩散。
　　
　　2.3 对虾的血细胞及其噬菌功能
　　
　　对虾血细胞分为三种类型，即无颗粒细胞（Agranular cell）、小颗粒细胞（Small granular cell）、大颗粒细胞(Large granular cell)。无颗粒细胞在电子显微镜下可见细胞中没有颗粒，在免疫系统中主要起着吞噬作用（Phagocytosis）。小颗粒细胞中，含有数量不同的小型粒，在免疫系统中主要起着确认外来分子及颗粒，并发生胞吐作用，释放酚氧化酶原系统组分，另外也参与包封作用（Encapsulation reaction）。大颗粒细胞含有大量的大颗粒和少量的核糖体与内质网，颗粒体内含有大量的酚氧化酶原。有学者认为，在对虾免疫反应中，对虾这三种细胞可能具有细胞协同作用：小颗粒细胞在异已物质的刺激发生胞吐作用，释放酚氧化酶原系统组分，这种组分既可以刺激无颗粒细胞的吞噬能力，又可以刺激大颗粒细胞释放更多的酚氧化酶原的系统组分，从而对细胞免疫反应发生作用。对虾血细胞主要通过吞噬作用在细胞内消化异物，以包围化的方式把组织内的异物隔离起来，这种方式是对虾体内免疫防御机能的主体。
　　
　　2.4 对虾酚氧化酶原激活系统（proPO system）
　　
　　对虾体内的酚氧化酶原激活系统是一种与脊椎动物补体系统类似的酶级联系统，主要是由丝氨酸蛋白酶和其它因子组成，以非活化状态存在于血细胞的颗粒中。当微生物或寄生虫等侵入体内时，其结构成分如真菌中葡聚糖或革兰氏阴性菌中的脂多糖等作为异已信号按一定顺序激活丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶随后又激活酚氧化酶原，将其转变为活性的酶氧化酶，可氧化酚生成醌，醌自发生成的最终产物是黑色素。黑色素及其形成过程中的中间产物醌均为高活性物质，可抑制病原体胞外蛋白酶和几丁质酶的活性，从而抑制甚至杀死病原体。另外，淡水螯虾中的酚氧化酶被激活以后能粘附到不同物体的表面，因此，酚氧化酶还有可能作为调理素，促进了血细胞的吞噬作用。研究结果发现，极微量的微生物多糖成分就可激活酚氧化酶原激活系统，如β-葡聚糖（β-glucan）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、肽聚糖（Peptidoglucan,PG）等。
　　
　　2.5 对虾血淋巴中的溶血素(Hemolysin)及其杀菌作用
　　
　　溶血素是一种非特异性的免疫防治因子，在日本对虾血淋巴中被发现，其作用可能类似于脊椎动物的补体系统，可溶解破坏异物细胞，参与调理作用，并且可能与酚氧分酶原激活系统有关。日本对虾血淋巴中的溶血素能够对鸡红细胞产生溶血作用，溶血活力的大小同与虾体质有密切关系，濒死对虾的溶血素活性显著低于健康对虾，因此溶血活性也可被用于检测对虾健康状况的一项定量指标。牟海津等（1999）发现日本对虾的溶血素具有一定的可诱导性，外源刺激物的诱导可以使血淋巴中的溶血素浓度有所提高。
　　
　　2.6 对虾血淋巴中的凝集素（Agglutinin）及其识别功能
　　
　　对虾体内具有一种能使细菌、脊椎动物的红细胞、某些寄生虫等发生凝集的因子，称为凝集素，它实际上是一种蛋白质或糖蛋白，它的作用类似于脊椎动物的抗体，是对虾体内的一种免疫识别因子。具体作用机制是：凝集素可以键结碳水化合物，若外来细胞的细胞膜上含有该凝集素可辨认的碳水化合物，即可对外来物质产生凝集作用，使其失去活性，有时由血细胞来完成吞噬及杀灭作用。另外也有研究发现，无颗粒细胞内或细胞膜上也存在有凝集素，无颗粒细胞也可以通过这种凝集素分子同异物分子进行接合，以便于对异物分子的进一步吞噬。
　　
　　2.7 对虾血淋巴中的溶菌酶（lysozyme）及其溶菌作用
　　
　　溶菌酶是非特异性免疫系统的主要成分，在对虾的免疫中起重要的作用。近年来，人们陆续从中国对虾、日本对虾、南美白对虾体内检测到溶菌酶的存在。它是一种碱性蛋白，主要杀灭革兰氏阳性细菌，具体作用机制是：溶菌酶能够破坏溶解革兰氏阳性细菌细胞壁粘性多肽中的乙酰氨基多糖，并使之裂解被释放出来，形成一个水解酶体系，从而破坏和消除侵入体内的异物，从而提高对虾机体的防御能力。
　　
　　2.8 对虾血淋巴中抗菌肽（Antimicrobial peptides）及其抗菌作用
　　
　　抗菌肽是具有抗菌活性短肽的总称，1981年瑞典科学家Steiner等首先从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，命名为天蚕素(Cecropin)，随后抗菌肽成为免疫学和分子生物学研究的热点。1997年Destoumieux等从养殖的南美白对虾的血细胞和血淋巴中分离了几种抗菌活性因子，其中3种具有抗细菌尤其是抗革兰氏阳性菌的活力，通过酶剪切，Edman降解、质谱仪分析等方法以及从血细胞的cDNA库中进行cDNA克隆，测定序列，发现南美白对虾抗菌肽penaeidins具有与其它抗菌肽相似的特点：均为阳离子肽，其中一种肽的N端因形成焦谷氨酸被封闭；最近Destoumieux等（2000）用免疫化学方法研究南美白对虾抗菌肽合成和储存的部位，发现受细菌感染后血淋巴中抗菌肽浓度会升高，抗菌肽的免疫反应发生在角质层，说明几丁质具有与抗菌肽相结合的活性。
　　
　　3 使用免疫刺激剂（Immunitystimulants）增强对虾免疫系统的防御能力
　　
　　免疫刺激剂提高对虾抵抗力不是通过特异性免疫反应而是通过提高非特异性防卸机制，因此使用免疫刺激剂对于提高对虾的免疫活性以及疾病抵抗力是一种有效的方法。对虾免疫刺激剂的研究正在进行，同时也有多种免疫刺激剂已在对虾养殖业上运用。
　　 
　　使用免疫刺激剂通常能提高对虾血细胞的吞噬能力，诱导提高对虾血淋巴中溶血素、溶菌酶、凝集素、抗菌肽的活性。鱼虾免疫刺激剂的研究是近二十年来鱼类学家关注的热点。表1列出了已有报道对鱼虾有效的免疫刺激剂，主要包括化学物质、细菌组分、多糖、动植物提取物、营养因子以及细胞分裂素。
　　
　　表1 在鱼虾上采用的免疫刺激剂
　　
　　合成的化学物质
　　左旋咪唑
　　FK-565
　　胞壁酰二肽（MDP）
　　生物类物质
　　（1） 细菌衍生物
　　β-葡聚糖
　　肽聚糖
　　佛氏完全佐剂（FCA）
　　脂多糖（LPS）
　　EF302
　　酪酸梭状芽孢杆菌细胞
　　无色真菌细胞
　　鳗弧菌细胞
　　（2） 多糖
　　几丁质
　　乙酰几丁质
　　磨菇多糖
　　Schizophyllan
　　低聚糖
　　（3） 动植物提取物
　　Ete（一种海水被膜物质中提取）
　　Hde（皱纹盘鲍中提取）
　　莹乌贼
　　Quill A皂角苷（皂树）
　　甘草
　　（4） 营养因子
　　VC
　　VE
　　（5）生长激素、细胞分裂素和其它
　　乳铁蛋白
　　干扰素
　　生长激素
　　泌乳刺激素
　　
　　上述众多的免疫刺激剂中，研究最多、效果较为明确的还是酵母β-葡聚糖。Robertsen等（1990）报道大西洋鲑腹腔内注射了从酵母细胞壁中提取的β-葡聚糖，可以提高大西洋鲑对杀鲑气单胞菌、鳗弧菌、鲁氏耶尔森菌的抵抗力。Chen等（1992）报道鲶鱼注射了β-葡聚糖后可以提高其对爱德华菌(E．ictaluri)感染的抵抗力。台湾省水产试验所1996年试验结果表明，在草虾饲料中添加200ppm的β-葡聚糖，可以将被注射弧菌（V.damsela）的草虾的存活率由0%提高到90%以上。Raa等（1992）报道大西洋鲑口服酵母β-葡聚糖后可以提高其对鳗弧菌、杀鲑弧菌的抵抗力。Song等（1994）报道草虾浸泡在β-葡聚糖溶液中也可提高其对创伤弧菌（V.vulnificus）感染的抵抗力。阳会军等（2001）试验表明，草虾饲料中添加400ppmβ-葡聚糖可以显著提高其增重率和抗病力。
　　 
　　也有报道指出，酵母β-葡聚糖可以提高大西洋鲑、虹鳟和大鲮鲆体内的溶菌酶的活性以及虹鳟、草虾、鲶鱼、大西洋鲑巨噬细胞或血细胞中过氧化物的产量。 
　　
　　4 免疫刺激剂使用的时机
　　 
　　使用免疫刺激剂的时机对其免疫刺激效果的发挥很关键。通常抗生素使用效果最好的时机是疾病发生的时候，但抗生素不能为了预防疾病而长期使用，因为这样很容易导致细菌产生抗药性。Anderson（1992）建议免疫刺激剂应在疾病爆发前使用，减少因疾病而导致的损失。免疫刺激剂可以恢复因压抑而导致的免疫抑制。Boonyaratpalin等（1995）也报道草虾如摄食了肽聚糖则会提高其对溶解氧、盐度以及环境压力的忍受力。使用免疫刺激剂如Ete的有效时机很难把握，如鳗鱼受嗜水气单胞菌（A.hydrophilla）攻击后2天再用Ete，Ete有很好的保护鳗鱼的效果，但如果在鳗鱼受嗜水气单胞菌攻击前2天或攻击时使用Ete，则Ete的保护作用不明显。
　　
　　5 免疫刺激剂的使用方法
　　 
　　很多作者已报道，注射免疫刺激剂可以提高鱼虾血细胞的吞噬功能以及其对病原菌的抵抗力，然而注射这种使用方法是劳动力密集型的，相对也是耗时的，特别是对于对虾来说，使用这种方法几乎不可能，因此其它方法如口服和浸泡被采用，这种方法对鱼虾不产生应激，而且不管鱼虾多大均可使用。口服免疫刺激剂可以提高鱼虾某些传染病如疖病、弧菌病、链球菌病的抵抗力。浸泡方法也可以被采用，然而对于免疫刺激剂的稀释浓度及其使用的效果水平还有待于进一步观察。
　　
　　6 结语
　　
　　近年来，由于对虾养殖业过分强调单位产量，以至于养殖过程中所产生的排泄物以及残饵等超过了水体的降解自净能力，进一步加剧了水环境的污染程度，因而使对虾频频发生各种细菌性和病毒性疾病。防治过程中大量使用抗生素或其它药物，又破坏了水体的微生态平衡，严重制约了对虾养殖业的发展，因此加快对虾免疫机理的基础研究，调动开发对虾自身的防御潜力，是开展对虾健康养殖、实现对虾养殖业可持续发展的重要战略之一。  
 





                                           采集：邓洁