恩诺沙星酶联免疫试剂盒质量标准

中国水产门户网报道本品系用恩诺沙星（ENR）偶联蛋白的抗原、恩诺沙星单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测鸡组织、虾、鱼和鸡血清中ENR残留量。
【物理性状】试剂盒外观完整，内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装，恩诺沙星（ENR）抗体工作液、底物液、终止液、标准品、浓缩洗涤液为透明液体，酶标记物为浅黄色溶液，试剂无菌检验均应合格。
【灵敏度测定】  取已包被好的酶标板12孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液各50µL，再加入ENR抗体50µL，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反应15min，用50µL/孔终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100，即百分吸光度值。以ENR浓度（µg/L）的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。
IC50（即0浓度标准溶液的吸光度值50％处所对应的ENR浓度）范围应在1.45µg/L ~3.26µg/L之间。
【特异性测定】  取已包被好的酶标板18孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液和阴性鸡肉样本提取液、10µg/kg和20µg/kg 两个浓度ENR标准品添加的阳性鸡肉样本提取液各50µL，再加入ENR抗体50µL，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反应15min，用50µL终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以ENR浓度（µg/L）的自然对数为X轴，百分吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和10µg/kg和20µg/kg 两个浓度ENR添加的组织样品的测定浓度。
阴性样品测定值均应在2.5µg/kg以下，10µg/kg和20µg/kg 两个浓度ENR添加样本回收率应在60%~110%之间。
【精密度测定】  取已包被好的酶标板32孔，每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液50µL，其它20孔加入4.5µg/L的标准溶液50µL，再加入ENR抗体50µL，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100µL酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50µL，避光37℃反应15min，用50µL终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。
20个微孔的4.5µg/L标准溶液的吸光度值的变异系数（%）应≤25%（n=20）。
【适用范围】用于定量、定性检测鸡组织（肌肉、肝脏等）、虾、鱼和鸡血清中ENR残留量。
【用法和结果判定】
1.  溶液的配制
1.1  0.1MNaOH溶液     0.4g      NaOH
            去离水100ml溶解
1.2  乙腈NaOH溶液   将乙氰与0.1M NaOH溶液按84：16的体积比混合
1.3  PB缓冲液配制      0.52g   Na2HPO4·12H2O
                           0.088g   NaH2PO4·2H2O 
                           去离水100ml溶解
1.4 稀释洗涤液  将20X浓缩洗涤液摇匀，用去离子水以1：20的比例稀释，临用前配制。
2.   样品前处理
2.1   鸡组织（肌肉、肝脏等）样本处理方法
2.1.1 称取2.0g均质过的鸡肉样本于50mL离心管中。
2.1.2  加入乙腈 NaOH溶液10mL，充分混合10min，3000g以上，15℃离心10min。
2.1.3  取出5mL上清液，加入0.02M PB缓冲液2mL，混合均匀。
2.1.4  加入二氯甲烷5mL，充分混匀10min，3000g以上，15℃离心10min。去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或氮气吹干。
2.1.5  用0.6mL 0.02M PB缓冲液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL，混合2min，3000g, 15℃离心5min。
2.1.6  轻吸掉上层有机相和中间部份液体，取下层50μL溶液，再加入150μL 0.02M PB缓冲液混匀即可分析。
2.2  鸡血清样本处理方法
2.2.1  用加有肝素钠（20~30单位/mL血）的离心管采集血样本，血样本室温静置1h，待析出血清后3000g，15℃离心10min，取出血清1mL。
2.2.2  加入3mL乙腈充分上下混合10min，3000g以上，15℃离心10min。转移上清至另一离心管中，加入1mL 0.02M PB缓冲液，混匀。
2.2.3  加入二氯甲烷4mL，充分混匀10min，3000g, 15℃离心10min。去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或氮气吹干。
2.2.4用0.6mL 0.02M PB缓冲液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min，取出3000g以上，15℃离心5min。
2.2.5  轻吸掉上层有机相和中间白色杂质，取下层50μL溶液，再加入150μL PB缓冲液混匀即可分析。
2.3  水产品样本的处理等同于鸡组织样本的处理方法
注：水产品提取中上述第1.2.5步，如果在两相之间出现太多的泡沫或胶状物，难以取出足够的下层提取液，应将样品瓶放在80℃水浴中5min后再离心。
3.   检测步骤
3.1  将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20~24℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
3.2  按需要取好微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2~8℃，不要冷冻。
3.3  编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。
3.4  加标准品或样本 50 mL /孔，然后加抗体工作液50 μL/孔，用盖板膜盖板，37℃水浴或恒温箱反应30min。
3.5  取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，拍干。
3.6  加酶标记物工作液，每孔100mL，用盖板膜盖板后置37℃水浴或恒温箱反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，拍干。
3.7  显色：每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，轻轻振荡混匀，37℃水浴或恒温箱避光显色15min。
3.8  测定：每孔加入2M终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定吸光度值（OD值）。
4.   结果判定
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝B×100%
B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以恩诺沙星标准品浓度（µg/L）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中恩诺沙星实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
【贮藏条件和保存期】
试剂盒应在2~8℃保存，保存期为6个月。
【规格】  每个试剂盒含96孔板一块，ENR标准品6瓶 1mL/瓶（0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L），ENR抗体工作液1瓶，7mL；酶标二抗工作液1瓶，12mL；浓缩洗涤液1瓶，40mL；底物液7mL各一瓶；终止液1瓶，7mL/瓶；盖板膜1张，自封袋1个；说明书1份；质量报告1份。
【注意事项】
1、剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌，防止试剂变质。
2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。
3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证，合格后方可用于特异性和准确度监控用。
4、严格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。
5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象，则视该批试剂盒为不合格。