台湾石斑虹彩病毒疫苗可望今年生产

      农委会主委陈武雄在2011年1月6日的兽医师节庆祝大会上宣布，家畜卫生试验所研发的石斑鱼虹彩病毒疫苗预计于今年取得制造许可。家畜卫生试验所初步已进行田间试验评估，并提出制造许可申请，在经委托单位重复实验确认，取得制造许可后，即可开始生产了。
 
    台湾石斑鱼苗的年产量高峰期在1999年，达2.8亿尾，之后逐年降低，至2009年仅剩2千3百万尾。台湾石斑鱼苗养殖业成长受限于石斑虹彩病毒及神经坏死病毒（NNV）所感染，鱼苗损失率高达七成。虹彩病毒会感染三十种以上的经济养殖鱼类，石斑种苗之感染后的累积死亡率为50～90%。
 
    虹彩病毒感染后主要是会造成造血织组坏死，主要病征会出现体色变黑、鳃盖张开及鳃部出血的情况，传染方式主要是以水平感染为主，这点与神经坏死病毒可透过种鱼垂直感染有很大的不同。目前石斑养殖业者对这两种的病毒性疾病仍是无法预防与治疗，能否获利赚钱只有看发病后所留下的存活成数多少来决定。
 
     负责疫苗研发的助理研究员黄淑敏在接受本刊专访时表示，农委会家畜卫生试验所自1991年开始针对水生动物进行疾病监测，经过几年监测发现，田间有好几种海水养殖鱼苗都有许多病原，主要是虹彩病毒及神经坏死病毒（Nervous Necrosis Virus, NNV），这两种病毒每年都有相同的疫情发生，在20种以上的鱼种造成全身性感染，致使种苗业者严重的经济损失。
 
    虹彩病毒科主要分成五个病毒属，分别为Iridovirus、Chlorirdovirus、Ranavirus、Megalocystivirus及Lymphocystivirus，其中会造成鱼类感染就属前三种；而在鱼类造成巨大经济损失分别为Ranavirus及Megalocystivirus，在台湾已发现同时具有两种病毒属之存在，这两种病毒属皆会造成高的疾病发生率及死亡率。目前，家畜卫生试验所仍然每年都会在田间进行病毒分离与监测，台湾主要流行的虹彩病毒株有三种基因型：GIV、RSIV及ISKNV。GIV为台湾本土株（目前只于台湾及东南亚有病例发生）；RSIV为亲近于日本分离发表之病毒株；ISKNV为亲近于中国大陆分离发表之病毒株。经长期监测发现，近期的虹彩病毒与10年前的病毒在基因定序上差异不大，经过几年的检测及分析后，黄淑敏认为他们应该可以再进一步以研发疫苗来解决虹彩病毒对养殖上所产生的困扰。
 
    1995年起研发疫苗

   自1995 年起，家畜卫生试验所开始着手进行石斑鱼的疫苗研发，黄淑敏说，要以疫苗为策略来控制疾病， 有些重要因素必须克服：第一，考虑疫苗之制程方法。因疫苗之制造方法又迁就于疫苗之成本及施予的方法；第二，选择目标鱼种。以台湾目前养殖之大宗鱼类种别为主要考虑，前期规划以青斑为主，后期加入龙胆石斑为标的鱼种；第三，选定疫苗株及种毒株。筛选具有免疫原性之疫苗株及具有宿主广范围感受性之种毒株；第四，疫苗安全性。选定对人类及鱼类皆有安全性之配方；第五，疫苗之稳定性及效力。测试疫苗之稳定性及找出有效评估疫苗效力之方法。在上述开发疫苗之几项前提要素，因有赖于家畜卫生试验所前副所长苏杰夫以前开发石斑肾细胞株的重大贡献，让他们能够利用已开发之细胞株进行野外病毒分离、增殖及力价测定，且能短时间内大量做体外复制病毒细胞，加速了而疫苗研发工作的进展。
 
    测试佐剂配方耗时一年

    家畜卫生试验所用化学药剂杀病毒（一般用福尔马林），这个步骤的关键是找出最适当的百分比，能杀死病毒又不伤到鱼。在制造出疫苗后的重点是佐剂，要能保存疫苗不让力价损失。家畜卫生试验所在1996年花了一年的时间，在不同之制成及配方中找寻最适当的处置，解决了疫苗乳化及保存的问题。关键点在疫苗与佐剂乳化后，力价要能稳定，并且能有一定的保存时间。结果显示：以腹腔注射混有佐剂B之疫苗，其保护指数为73%，混有MVP佐剂疫苗之保护指数只有50%，腹腔注射的免疫效果较肌肉注射效果为佳。
 
    总共44个配方中，他找到了2～3个佐剂配方能让疫苗保存一年。「每试一种配方都要3～4个月的时间，才能知道效果好不好。」佐剂配方不对的话，乳化之后以4℃冷藏保存会产生分层现象，保存一年后7成的效果降到只剩4成。她说，已经退休的前水试所生物科技研究中心研究员张正芳博士在这方面给了很多的协助，除了帮忙养鱼以外，还有给毒、测试疫苗力价，帮忙评估疫苗效果。
 
    克服了乳化技术后，随即进行基础测试，了解最佳效果的剂量是多少。最初施打一剂，之后再攻毒，发现有时有保护力，有时又没有。经过反复的测试，在10公分青斑苗以0.1㏄剂量施注射一剂，14天后施打第二剂补强，就能够给予青斑对虹彩病毒足够的保护效果，而且无论注射2剂量或1剂量之试制疫苗对鱼体都没有不良反应。
 
    1999 年初步疫苗田间试验

    经过了细胞培养、增毒、不活化及佐剂的四个疫苗研发必经的程序之后，石斑虹彩病毒疫苗终于研发成功，来年在所里经反复的实验后，于1999年开始进行田间试验。但是事情并非想象中容易，家畜卫生试验所面临找不到愿意配合进行田间试验之场主；为此，黄淑敏透过屏东县家畜防治所徐所长的关系，才在屏东县找到一个石斑鱼中间育苗场协助做田间试验，另外一个田间试验场则是台南黄姓业者主动透过台南县家畜疾病防治所找到了家畜卫生试验所，该所选定点带及龙胆两个石斑场进行石斑鱼虹彩病毒不活化疫苗田间试验。在中间育成场里，他们选取2 吋半尺寸的健康石斑鱼苗，每批试验约5千尾，以腹腔注射第1剂量之疫苗后间隔14天，再补强接种第2剂之疫苗。注射疫苗后第3个月、第6个月、第9个月及第12个月购回免疫的鱼只回到所里进行效力试验及代谢性评估。

    同时也观察田间实验期间各组之存活率、注射安全性与体重和体长之生长情形，以评估疫苗使用与否对经济效益之差异。初步结果显示，在注射疫苗之安全性评估部分：建议使用于大于10 克以上之石斑鱼阴性场，而其注射方式及免疫流程如麻醉程度、恢复状况，都需要经过专业的训练和事前评估。
 
    龙胆石斑的对照组与实验组之存活率都是100%，不过实验组的增重明显优于对照组，青斑经免疫后11 个月，其存活率为74.6%；对照组之存活率为50%。在实验室之效力评估：在龙胆石斑于免疫后3及6个月之疫苗效力是合格的，青斑于免疫后3个月之疫苗效力是合格的，免疫后6个月其对照组用最高之病毒力价攻毒已无法造成死亡。黄淑敏说，青斑此鱼种对病毒较具抵抗性，放养6个月后就不怕病毒，抗病力比龙胆强。在实验室里用强毒攻击一样大小的青斑及龙胆，青斑没事，龙胆会发生死亡情形。

    业者期盼疫苗带来保佑
 
    黄淑敏表示，试制疫苗于青斑及龙胆石斑之试验场皆获得有效之保护效果，除了鱼只之存活率显著优于对照组之外，有施打本疫苗其体重增重皆优于未施打者，这个结果与日本的报告结果吻合。「注射疫苗后的石斑苗食欲好，摄食量大，成长比较快，育成率也提高了，而且体色偏向青绿色，看起来健康有活力。」
 
    目前家畜卫生试验所只作青斑及龙胆，其它的石斑鱼种，因为未曾做过实验，尚不得而知，但业者希望也能做虎斑的疫苗，因为虎斑的经济价值更高。

    家畜卫生试验所研发的疫苗以注射方式施打，因此以室内育苗池会较方便操作。根据估算，石斑疫苗的直接成本约2元，以注射方式施打，连工带料的成本约3元。如果想给石斑苗较好的抗虹彩病毒能力，每条鱼施打两剂，要花成本约6元，这样划不划算呢？据后续的私下了解，成鱼养殖业者自田间试验场购买青斑苗一万余尾，并做了养殖对照观察，施打疫苗组育成率7.5成，4,500尾售得74万，未打疫苗的养殖组育成率5成，所得减少约24.7万。也就是说，每尾鱼以2剂6元成本计算，投资2.7万元疫苗成本，多卖了22万的额外利润。
 
    台南的田间试验场场主也表示，免疫过的龙胆苗饲料效益超乎想象中的好，连自己都不太敢相信。从3吋养殖1年可以长到4斤以上，成长速度真的很快，这是养殖鱼类里很少见的，连海鲡都比不上。不过这可能也与其养殖设备有关联，台南田间试验场是抽取地下海水，并加盖温棚，在冬季水温都还可以维持在25～26℃。一般育苗场冬天的水温会降到20℃左右，鱼苗会停止摄食，生长也停下来，饲育的时间会拉长1～2个月。
 
    业者表示，近年养殖龙胆石斑的业者都会遇到病毒的困扰，15公分到2～3斤的鱼都还会因为感染虹彩病毒或神经坏死病毒而死亡，造成损失，如果能有疫苗做防疫，增加石斑苗及成鱼的育成率，会是养殖渔民的〝保佑〞。
 
    如果能顺利取得制造许可，家畜卫生试验所估计，其GMP厂每年最多能制造大约1百万剂。根据渔业署的渔业年报统计，2009年台湾石斑鱼苗生产约2千3百万尾，家畜卫生试验所的虹彩病毒疫苗年产1百万剂，只能够为50万尾做免疫，施打率无法普及，未来可能会将疫苗生产技术移转给民间企业。