罗非鱼无乳链球菌病分子诊断技术

中国水产门户网报道 通威股份动物保健研究所生物技术部

　　无乳链球菌根据蓝斯费氏群分类为B群链球菌，可感染多种水产动物，引起罗非鱼、虹鳟、海鲤和鲻鱼等鱼类败血症和脑膜炎，具有较高的致病率和致死率。近年来由无乳链球菌引起的罗非鱼暴发性疾病在我国广东、广西、海南和福建等地区时有发生，暴发范围广，死亡率极高。

　　目前，临床上对无乳链球菌的检测方法主要依靠对患病样品的症状观察以及对病原物的镜检、分离、培养和生化鉴定，但这些方法或者依靠经验，极易导致误诊，或者操作繁琐，检测周期长，不利于临床上人们对患病鱼的快速诊断。

　　随着分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应技术在检测水产动物致病菌方面得以广泛应用。PCR技术检测的靶标是病原菌的遗传物质也即核酸，由于特定物种的核酸序列具有独特的排列顺序，因此PCR技术具有极强的检测特异性;PCR技术也是一种核酸物质的扩增放大技术，PCR反应结束以后病原菌的核酸序列可被放大至少千万倍，因此具有极高的检测灵敏度。

　　根据无乳链球菌两个高度保守的毒力基因设计了针对这两个基因的特异性引物，建立了快速、准确的无乳链球菌双重PCR快速检测方法。

　　结合快速简便的样品处理技术，该PCR方法可在四个小时之内(包括制备样品)对送检的样品进行准确的诊断，诊断结论包括是否无乳链球菌、在哪些组织中感染有无乳链球菌以及所感染的细菌的数量。

　　研究结果表明，动物保健研究所建立的无乳链球菌PCR快速诊断方法只能特异性地检出无乳链球菌及其DNA，不能检出海豚链球菌、嗜水气单胞菌、■爱德华氏菌等其它病原菌;对无乳链球菌DNA的最低检出浓度为7.632×10-2 ng/μL。

　　研究人员使用建立的方法对人工感染无乳链球菌的30尾罗非鱼的肝脏和肾脏组织中的无乳链球菌直接进行了检测，结果所有肝肾组织中均能检测出阳性结果，表明所建立的PCR方法可以用于患病样品的快速诊断。

　　无乳链球菌PCR检测方法的建立可以对罗非鱼无乳链球菌的早期感染情况进行监控，对于罗非鱼无乳链球菌感染病例的早期监测和及时预防具有重要意义。

　　此外，通威股份动物保健研究所还建立了海豚链球菌、■爱德华氏菌、柱状黄杆菌、气单胞菌属等其它水产养殖中常见病原的快速诊断方法，在此基础上建立了高效、准确、完整的微生物快速诊断平台，获得发明专利3项。

　　微生物快速诊断平台的建立为病原快速确诊、病害早期监测和防治以及水产健康养殖提供了重要技术保障。