中国水产门户网报道郑昌峰
（福建省发育与神经生物学重点实验室，福建师范大学生命科学学院，福建福州350108）
摘 要：多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)和刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是两种对鱼类最具致命性的寄生性纤毛虫, 分别引起淡水和海水鱼类的“白点病”。多年来，该病给淡水和海水养殖造成了极大的经济损失。免疫学方法是防治“白点病”流行极具潜力并且具有诸多优点的方法。目前尚无商业化疫苗出现。从“白点病”可能的疫苗开发方向出发对目前“白点病”的免疫防治研究现状进行综述，以期对未来的研究提供参考。
关键词：多子小瓜虫；刺激隐核虫；白点病；免疫防治；疫苗
多子小瓜虫和刺激隐核虫分别俗称淡水小瓜虫和海水小瓜虫。它们的生活史非常相似，都存在以下三个阶段：寄生于宿主的滋养体阶段、包囊阶段、具有感染宿主能力的幼虫阶段。这两种寄生虫宿主范围都很广泛，能分别感染大多数淡水和海水鱼类。感染了这两种寄生虫的鱼，可以在其体表和鳃上看到“白点”。近年来，随着水产养殖集约化程度的不断提高、养殖密度的不断加大，它们引起的问题日益突出，已造成极大的经济损失。目前主要采用物理和化学的方法进行防治，虽然起到了一定的效果，但它们都或多或少存在缺陷。如不适合大水体、效果不确定等，尤其是化学药物对鱼类的毒性、对环境的污染以及药物残留所引起的人类健康等问题，使这些方法备受质疑。利用疫苗进行免疫防治，就不会存在这些问题。随着各种鱼类细菌、病毒疫苗的陆续上市，人们也希望开发出“白点病”疫苗。目前白点病疫苗研究主要涉足三个方向：全虫疫苗、重组疫苗、DNA疫苗。与多子小瓜虫相比，刺激隐核虫在这些方面的研究相对比较滞后，它的很多研究思路都是借鉴多子小瓜虫的。虽然目前的研究并不支持“刺激隐核虫是多子小瓜虫的海水对应种”这种说法，可能是这两种生物趋同进化的缘故，它们的生活史、引起的病理特征、感染模式等许多方面都非常相似。所以在白点病疫苗开发过程中，任何研究成果在它们之间是可以共享和借鉴的。笔者在此对它们的疫苗研究现状进行概述，其中也明析了研究中遇到的一些主要问题，希望能给白点病防治提供参考。
1 全虫疫苗
针对这两种寄生虫，许多研究工作者用不同的全虫材料感染或免疫鱼类，评价其使鱼类产生免疫保护的效果，得到的存活率、平均致死天数等数据不尽相同。这些差异的造成可能与鱼的种类、全虫材料种类、免疫的剂量以及免疫的方法有关。但总体而言，从这些研究中可以清楚地看出，全虫材料可以使鱼获得免疫保护，其中无论采用浸泡感染还是腹腔注射，活的幼虫效果是最好的，这就为用全虫做疫苗提供了可能。用全虫做疫苗，目前遇到的最大障碍是没有足够全虫的持续供应，于是科研工作者们开始从不同角度解决这个问题。
1.1 多子小瓜虫
解决全虫供应问题的首要方法就是用易感染的鱼作宿主，进行实验室传代。但随着传代循环的增加，小瓜虫会出现衰老现象，感染力逐渐下降，最终实验种群消失。虽然Noe和Dickerson报道称他们实验室采用低温9℃成功进行了传代，延长了每个传代周期的时间,减少了传代的次数，在一定程度上减少了精力、财力的消耗，但并没有解决衰老这个根本问题，在连续传14代后，幼虫感染力几乎消失殆尽。Xu等通过对室温条件下105个传代循环的研究，指出当衰老迹象开始出现后，要逐渐加大实验组中感染鱼和未感染鱼的比例，但并没有后续的传代报道，用此方法能否使传代不断进行下去仍是个疑问。
除了通过实验室不断传代来满足研究对寄生虫材料的需求外，有人设想把包囊或幼虫像细菌一样保存起来，到实验需要时，再通过实验传代大量获取，这样就避免了不断传代的麻烦。Everett等对玻璃化法低温保存生物材料的程序进行优化，此方法保存的部分多子小瓜虫幼虫解冻后仍具有正常的形态、大小和纤毛运动能力。
与四膜虫相比，在野生环境中，小瓜虫整个生活史的完成需要宿主参与。于是人们尝试着不用鱼做宿主对小瓜虫进行体外培养。Ekless等对多子小瓜虫各个时期的虫体在细胞培养基上进行了短期培养，发现培养基延长了虫体的存活时间，但并没有刺激幼虫或滋养体的生长和进一步发育。Nielsen等在24孔细胞培养板中人工模拟了鱼的上皮环境，不仅观察到具有感染能力的幼虫吸附到上皮细胞上，而且观察到幼虫到滋养体的发育、滋养体从36～46μm的生长，实验显示了鱼的血清和粘液在这个过程中的重要作用。这在一定程度上说明小瓜虫可以进行体外培养。
目前，在多子小瓜虫体外培养技术尚不成熟的情况下，用其他寄生虫刺激鱼类的非特异性免疫来抵抗多子小瓜虫感染的研究，也应引起注意。至少，它可以使鱼建立起免疫保护，在一定程度上防止严重的白点病暴发。因为四膜虫很容易在体外培养，这方面的研究，以用四膜虫居多。这个策略最早是由Goven等采用， Dickerson等和Houghton也做了类似的免疫实验，存活率有所改观。Sigh等用福尔马林固定的数量达6800只的四膜虫腹腔注射褐鳟，3种四膜虫都能使鱼获得免疫保护，同时发现:与1种四膜虫免疫的鱼相比，3种四膜虫混合免疫的鱼体表滋养体的数目要少。
1.2 刺激隐核虫
第1次涉及到刺激隐核虫实验室传代的研究由Colorni进行。之后，Burgess、Yoshinaga、Dan等先后分别用鲻鱼、茉莉花鳉、卵形鲳鲹作宿主成功进行了传代。Dan建立的传代方法每个循环的产量最高达到用于感染的幼虫数的122倍，最低达61倍；一个循环从每条鱼体上获得的平均幼虫数可多达100万。而Burgess等获得的数据最高是11.7倍；Yoshinaga等从每条鱼身上仅得到50～500个滋养体。显然Dan建立的传代方法的产量要高很多，其原因可能与传代所用宿主有很大关系。另外，幼虫从包囊中出来后，其感染力随时间是减弱的，Dan等用的是脱囊后2h的幼虫，感染力会更强，这也可能是其获得高产量的一个原因。
关于刺激隐核虫的保存，Dan等采用了低温法。滋养体和包囊在12℃可分别存活5个月和4个月。保存4个月的滋养体和保存3个月的包囊仍能产生具有正常感染力的幼虫。研究还发现滋养体更适合保存。这个研究在一定程度上支持了冬季过后来年春季刺激隐核虫来源的一种解释：Dan等研究用的刺激隐核虫的采集地在大亚湾，冬季最低气温11.5℃，12～15℃的气温至少持续30d，冬季水温降低时，刺激隐核虫滋养体脱离宿主，进入休眠状态，来年春季，水温升高，脱囊产生幼虫，继续感染宿主。
Yambot和Song用包含有寄生虫吸附基质的培养基对其进行体外培养实验，不仅观察到幼虫吸附到胰酶大豆琼脂块固体基质上，而且观察到幼虫到滋养体的转变、生长。当把培养基中L15培养基含量从22.5%增加到30%、胎牛血清含量从2.5%增加到20%时，幼虫虽没有吸附在基质上，但其转变成滋养体之后，在培养基中反而得到更好的生长。因为没吸附的寄生虫更容易被收集，所以，如果幼虫真可以不需要吸附而得到转变和更好生长的话，那么这将极大方便刺激隐核虫的体外培养。Yoshinaga等在2007年报道了刺激隐核虫整个生活史的体外成功培养。收集到的幼虫的感染力和正常宿主传代相当，但不同培养批次在产量方面的稳定性不太理想。目前，用其他纤毛虫如四膜虫来进行防治刺激隐核虫感染的研究，还没有相关的文献报道。
2 重组疫苗
用多子小瓜虫感染鱼，鱼血清在体外可以抑动多子小瓜虫。一些与这种抑动现象有关的抗原——抑动抗原已经鉴定出来。这些抑动抗原是多子小瓜虫表面非常丰富的膜蛋白，它们是免疫反应的靶分子，可以作为多子小瓜虫疫苗的候选分子。异源表达重组抑动抗原可以克服天然抗原供应问题，可以随时根据实验需要获得。
2.1 用大肠杆菌作表达系统
Clark等首次从多子小瓜虫cDNA文库中分离出抑动抗原IAG48A[G1]的部分cDNA片段并进行了相关的核苷酸序列和氨基酸序列分析。这些工作为异源表达抑动抗原提供了可能。He等构建了一个长316bp的基因片段，其编码48kDa抑动抗原的一个表位，并且在大肠杆菌中得到成功表达。用表达出来的重组抗原GST-iAg1免疫金鱼，免疫组存活率优于对照组，说明重组抗原GST-iAgI可以使鱼对多子小瓜虫产生免疫力。因为UAA和UAG这两个密码子在多子小瓜虫和刺激隐核虫基因中编码的不是终止密码子，而是谷氨酰胺，而且通常情况下，在一个基因中这两个密码子出现的次数也比较多，所以为了可以在大肠杆菌中表达，Lin等采用组合PCR合成了多子小瓜虫抑动抗原基因IAG52A[G5]。去除信号区域的基因亚克隆到pGEX-6P-1表达载体上，得到高效表达。但无论用谷胱甘肽琼脂糖凝胶还是用镍离子亲和层析柱纯化目标蛋白，效果都不理想。相关的鱼免疫攻毒试验也无法进行。因此Lin等提出了用细菌细胞裂解产物或全细菌细胞直接作为疫苗想法，但它们的有效性有待进一步研究。
2.2 用四膜虫作表达系统
用真核生物四膜虫作为表达系统的优势在于：同属纤毛虫的四膜虫在密码子偏好性上更贴近多子小瓜虫，尤其是UAA和UAG这两个密码子在四膜虫中编码的也是谷氨酰胺。这样可以避免大量诱变过程，减少实验成本。
Gaertig等在1999年报道他们成功用四膜虫表达了多子小瓜虫抑动抗原IAG48A[G1]基因，表达产物定位于四膜虫细胞表面。随后，Shang等用MTT1启动子成功过表达了多子小瓜虫IAG48[G1]基因，该启动子还可以极大增加DNA转化的效率。用转化后的四膜虫活细胞处理鱼，鱼对这个血清型多子小瓜虫感染产生了较强的免疫保护。然而，目前抑动抗原的表达都需要重金属Cd2+诱导，体外实验证明一定浓度Cd2+对滋养体也有致死作用的，所以就不清楚这个保护作用归功于免疫反应还是Cd2+。Bisharyan等通过研究排除了Cd2+作用的可能。另外，Bisharyan等检测到在鱼免疫14d之后鱼肌肉中Cd2+浓度是23ppb，这个浓度低于规定的鱼产品中Cd2+的含量，略超出人体内Cd2+正常范围，而且随着鱼的继续生长和排泄作用，这个浓度可能会进一步降低。尽管如此，重金属Cd的使用还是会引起人们在环境和健康方面的担忧。因此现在人们正在考虑相应的措施，进一步降低由重组四膜虫疫苗带来的重金属Cd的浓度。
3 DNA疫苗
DNA疫苗是一种相对比较新的疫苗种类。优势在于它使用的是核苷酸序列，而不是抗原本身，不需要考虑抗原供应问题，而且它诱导的免疫保护能持续更长时间。目前，对鱼类棒状病毒的DNA疫苗研究已取得一些可喜的成果。用DNA疫苗肌肉注射鲑鱼，鱼肌肉细胞可以表达病毒蛋白并使它暴露于免疫系统中，致使免疫反应的发生，提高了鲑鱼抵抗病毒的能力。Lin等把去除一段序列的抑动抗原基因IAG52A△C19[G5]连接到载体pcDNA3.1（+）上，用这个重组载体肌肉注射免疫斑点叉尾鮰，免疫鱼的血清用Western blot检测，抑动抗原AG52A[G5]免疫的鱼血清作对照，结果显示：实验组出现了阳性信号，所在位置和对照基本一致。说明IAG52A△C19[G5]基因的确在鱼肌肉细胞中得到了表达,并使鱼产生了免疫反应，有特异性抗体生成。
目前，发现的多子小瓜虫株分属5种血清型（A、B、C、D、E）。除血清型D只表达一种抑动抗原外，其它均不止表达一种抑动抗原。这些抑动抗原大小40～70kDa。有关刺激隐核虫的抑动抗原研究，也取得一定成果，已鉴定的抑动抗原或可能的抑动抗原的分子量分别为32kDa、37kDa、34kDa、40kDa，都小于多子小瓜虫的抑动抗原。
32kDa和37kDa抑动抗原被确定来自两种不同的血清型。34 kDa和40 kDa“抑动抗原”都来自刺激隐核虫GD1。但不清楚后两个与32kDa或37kDa抑动抗原是否来自同种血清型，所以刺激隐核虫的血清型分类需要进一步完善。不管如何，Hatanaka等已分离出32和37kDa抑动抗原cDNA克隆，并进行相关的序列分析，这为异源表达刺激隐核虫抑动抗原以及进行DNA疫苗研究带来了希望。
另外，无论在多子小瓜虫还是刺激隐核虫研究中，都发现：（1）用全虫材料免疫鱼，不同血清型之间存在交叉免疫保护现象，且不同血清型之间的交叉免疫效果存在差异。（2）用抑动抗原免疫鱼，免疫保护存在血清特异性。从这两点，可以明显看出，还有其他表面或分泌抗原在鱼的免疫反应中发挥作用。关于其他有可能作为候选疫苗的抗原，Lokanathan等在其论文中有详细的分析。这样，重组疫苗和DNA疫苗的应用可能不只限于抑动抗原，也许将来会用几种重组疫苗或DNA疫苗来联合抵御病害。在刺激隐核虫的免疫研究中，发现刺激隐核虫免疫鱼的血清和皮肤粘液的抑动效价远比同样剂量的多子小瓜虫免疫的要低得多，原因可能是刺激隐核虫表面的抑动抗原没有多子小瓜虫的丰富或刺激隐核虫表面抗原的免疫原性并没有多子小瓜虫强，也可能是，虽然免疫鱼产生很好的免疫反应，但刺激隐核虫的游动速度更快，纤毛更健壮，产生的抗体不容易阻止纤毛运动。所以在刺激隐核虫的免疫防治中，更有可能需要几种重组疫苗或DNA疫苗的联合作用。
4 结语
白点病已引起水产养殖极大的经济损失，免疫防治被寄予厚望。正如Medzhitov所言，对于宿主生物，重要的不是被诱导的免疫反应本身，而是产生的免疫反应能否对特定的病原感染起到保护作用。无论用多子小瓜虫或刺激隐核虫自然感染还是人工免疫，都已证实了这两种寄生虫可以刺激宿主鱼产生保护性免疫反应，这就为开发疫苗对白点病进行免疫防治奠定了很好的基础。关于其中保护机制的研究，目前主要集中于特异性抗体，但仍有诸多问题需要解决。所以在白点病疫苗开发的道路中，除了文中提到的一些问题需要解决外，为了最佳抗原、最佳免疫佐剂以及最佳免疫程序的选择，需要进一步阐释其中的免疫保护机制。
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